Categoría: Soja | Calidad

Nuevo recipiente para análisis de Geminación y Sanidad de semillas: uso en Patología

Palabras clave: soja, análisis sanitario, recipiente

  
Introducción

Cuando hablamos de calidad de semillas hacemos referencia a una serie de atributos o propiedades de las mismas, que nos informan sobre el valor que tiene el lote para utilizarlo como simiente. Entre estos podemos hablar de la pureza genética, la pureza físico botánica, la viabilidad, la germinación, el nivel de daños mecánicos que presentan las semillas, los daños fisiológicos, los daños por picaduras de chinches, etc. Existe también otro atributo que define la calidad de las semillas, el estado sanitario del lote, que es muy importante ya que informa sobre los organismos patógenos portados por las semillas y la magnitud de la infección. Generalmente los hongos patógenos que colonizan las semillas no son visibles a simple vista y se deben conducir diferentes ensayos de laboratorio denominados Análisis Sanitarios. Los ensayos se realizan sobre papel, más comúnmente conocidos como Blotter Test, sobre agar, Agar Test o en casos especiales en medios de cultivos selectivos para el desarrollo de patógenos específicos. Los ensayos se conducen en los laboratorios de Control de Calidad acreditados y que cumplen con las metodologías establecidas por la Reglas de la Asociación Internacional de Análisis Semillas (ISTA, 2003). Para su ejecución los ensayos requieren de la utilización de 400 semillas, en 40 cajas de Petri conteniendo el sustrato o el medio de cultivo. El uso de estos recipientes y el método de evaluación visual tradicional presenta ciertas desventajas: 1) consumen gran espacio físico dentro del ambiente de incubación, 2) no quedan registros visuales de los resultados de la prueba una vez evaluado el ensayo y 3) no se dispone de un archivo probatorio complementario de la calidad que se informa en el certificado de análisis. En el Laboratorio de Semillas de la EEA Oliveros del INTA, se desarrolló una nueva herramienta para utilizar en el Control de Calidad de Semillas que se trata de un nuevo recipiente denominado Casete de Germinación y Sanidad Semillas (patente Nº 040101501). El objetivo del trabajo fue evaluar la aptitud del nuevo recipiente de germinación y sanidad de semillas aplicado al diagnóstico de calidad sanitaria de semillas de soja, y permite conjugar las ventajas de los métodos tradicionales con las nuevas herramientas relacionadas con imágenes digitales y su manipulación informática.

  
Materiales y Métodos

Los ensayos se condujeron en el Laboratorio de Semillas de la EEA Oliveros del INTA, Santa Fe, Argentina. Se utilizó semilla comercial de soja del CV. Don Mario 3700, que se sembró el Casete de Germinación y Sanidad de Semillas (INTA – Rizobacter Argentina) utilizándose 400 semillas en 16 repeticiones de 25. El casete es un recipiente rectangular de 310 mm de largo X 245 mm de ancho y 30 mm de espesor, con doble compartimiento con tapas transparentes de superficies escaneables (210 x 297 mm) (Craviotto, et. al, 2006) (Fig. 1). Al cerrarse el casete se generan dos recipientes o cajas de siembra independientes donde se colocan los suplementos. Posee un suplemento específico para la Prueba de Sanidad/Patología que consiste en dos estructuras, el Recipiente de Incubación y las Placas de Siembra, que se complementan entre sí para permitir la incubación de las semillas durante el ensayo (Fig. 2). El Recipiente de Incubación es una caja rectangular de policarbonato transparente dividida en cuatro compartimentos de 105 mm X 150mm. En cada uno de ellos se coloca el sustrato elegido para realizar la prueba, que puede ser papel o agar. Las Placas de Siembra son estructuras planas de 100 mm X 144 mm que se ubican en cada compartimento y poseen 25 perforaciones circulares de 18 mm de diámetro donde se depositan las semillas a incubar individualmente. Las perforaciones de la Placa de Siembra poseen un pequeño reborde que al cerrar la tapa del casete genera un ambiente perfectamente independiente para cada semilla. Esta separación espacial es importante para evitar la contaminación de una semilla con el inóculo proveniente de otra y de esta manera limita en parte el desarrollo de las colonias de hongos favoreciendo su identificación. Previo a iniciar la siembra de las semillas se procedió a la desinfección de todas las partes del casete con hipoclorito de sodio al 1.05% (Henning, 2004). 

Siembra con Sustrato Papel. Se trabajó con el Recipiente de Incubación ubicado dentro del casete. Se utilizó como sustrato papel de germinación Schleicher & Schuell, (Unisfera LTD, Bs. As. Argentina), (65gr/m²), cortado previamente al tamaño adecuado para colocarlos dentro de cada compartimento del Recipiente de Incubación. Sobre dos papeles húmedos a saturación (100% de su capacidad de retención de agua) se ubicaron las Placas de Siembra y en cada perforación se colocó una semilla de soja. Las semillas no se desinfectaron ni esterilizaron superficialmente antes de la siembra. Luego se cerró cuidadosamente la tapa del casete y se procedió a sembrar de igual forma la otra cara, se cerró y se colocó en posición vertical dentro de la cámara de incubación, a 30°C durante 4 días en oscuridad (Fig. 3). Para evitar pérdidas de humedad del sistema se introdujo el casete dentro de una bolsa de polietileno. Las semillas quedan perfectamente ubicadas en cada perforación de la Placa de Siembra retenidas entre el sustrato de papel húmedo y la tapa del casete. 

Siembra en Agar. Se trabajó con el Recipiente de Incubación ubicado dentro del casete .Se preparó un medio de cultivo en base agar-agar en una concentración de 5%. En cada compartimento se colocaron 30 cc de medio de cultivo líquido, inmediatamente se ubicaron las Placas de Siembra sobre el mismo y se cerró el casete. Luego de la solidificación del medio de cultivo (10 minutos aproximadamente) se procedió a la siembra de las semillas en cada perforación de la placa. Posteriormente se cerró el casete, se dio vuelta y se procedió de igual manera con el otro lado. Una vez finalizada la siembra se colocó el casete dentro de una bolsa de polietileno y se ubicó en posición vertical en la cámara de incubación a 30°C durante 4 días en oscuridad. 

Durante el periodo de incubación se realizaron observaciones diarias para registrar la producción y evolución de los micelios y colonias de hongos en su interior. 

Al finalizar el período de incubación, se retiró el casete y se realizó el escaneo de ambas caras del casete para generar el archivo digital del análisis (Fig. 4). En el caso del sustrato agar se realizó además el escaneo de la cara inferior del Suplemento de Patología una vez retirado del casete (Fig. 5). Con posterioridad se realizó la evaluación e identificación de las colonias desarrolladas en el casete en forma manual tradicional abriendo el casete y/ o digital directamente desde la pantalla de la PC a partir de la imagen escaneada.

En ambos sustratos utilizados las semillas quedaron retenidas dentro de las perforaciones de las Placas de Siembra, prácticamente confinadas entre el sustrato y la tapa transparente del casete. Las semillas no se movieron cuando se ubicó el casete en posición vertical dentro de la cámara de incubación. En el Agar Test , por las características propias del medio de cultivo, se logró una mayor adherencia con las semillas que quedaron prácticamente pegadas al sustrato.

Se observo un normal desarrollo de colonias de hongos patógenos a partir de las semillas sembradas tanto en el Blotter Test como en el Agar Test. Los micelios originados por los diferentes géneros y especies de hongos presentes sobre las semillas crecieron en forma adecuada en los espacios circulares de la placa de siembra.

En ambos sustratos utilizados ya a las 48 hs de incubación comenzaron a aparecer micelios de patógenos y se realizó una identificación precisa de los mismos.

El diseño de la Placa de Siembra con perforaciones circulares y bordes sobreelevados permitió un buen desarrollo de los micelios de las colonias de hongos en su interior y también el confinamiento de los mismos de manera de no contaminar semillas vecinas.

La temperatura de incubación de 30 °C en oscuridad permitió lograr un rápido crecimiento de micelios en ambos sustratos y realizar una evaluación anticipada.

Las observaciones del casete realizadas diariamente permitieron monitorear la aparición y crecimiento de colonias de hongos en forma ágil y equivalente al análisis simultáneo de 10 cajas de Petri tradicionales por cara del casete. De igual modo el escaneo diario de las caras del casete permitió realizar un seguimiento y archivado digital de la evolución del ensayo. Esta información permite tomar decisiones importantes sobre el lote de semillas en la rutina de los laboratorios de análisis de calidad. Estos aspectos pueden estar referidos a la necesidad de continuar con el ensayo, repetirlo, cambiar de sustrato, dar resultados anticipados, etc. Los archivos digitales del análisis creados sirvieron además para crear bases de datos para capacitación, entrenamiento e intercambio de información con otros laboratorios.

La evaluación del análisis se pudo realizar directamente en forma visual tradicional sobre el casete abierto y/o cerrado o sobre la pantalla de la PC desde la imagen escaneada. Esto último permitiría además realizar un análisis diferido en el tiempo y adaptar el mismo a las necesidades operativas del laboratorio.

El casete de semillas resultó una herramienta útil para conducir el Análisis Sanitario con distintos sustratos.

El diseño del casete de semillas permite un mejor aprovechamiento del espacio de la cámara de incubación, ya que un espacio de 30 mm de espesor que reúne en su interior 200 semillas en espacios individuales (4 repeticiones de 25 semillas por cara del casete), equivaldría al espacio necesario para incubar 20 cajas de Petri.

El método aprovecha todas las cualidades del método tradicional con cajas de Petri o Gerbox, a la vez que incorpora la posibilidad del menor espacio ocupado, escaneo y archivado digital del ensayo, intercambio en tiempo real de los resultados de análisis con otros laboratorios, incorpora trazabilidad al laboratorio, agiliza el seguimiento del ensayo, construye un banco de imágenes, incorpora las ventajas de la manipulación de imágenes digitales, etc.

Fig. 1 Casete de Germinación y Sanidad.	Fig. 2 Suplemento de Patología:  a-Recipiente de Incubación y  b- Placas de Siembra.
Fig. 3 Ubicación del casete en posición   vertical	Fig. 4 Imagen escaneada del Suplemento  dentro del casete. Desarrollo de colonias  en Blotter Test
Fig. 5 Imagen escaneada del Suplemento  dentro del casete. Desarrollo de  colonias en Agar Test.	Fig. 6 Imagen escaneada de la parte inferior  del Suplemento en Agar Test.

Agradecimientos

A los auxiliares y analistas del Laboratorio de Semillas de la EEA Oliveros que contribuyeron a la realización del ensayo.

 
Bibliografía

Craviotto, R.M.; Arango Perearnau, M.R.; Gallo, C. Casete de Análisis de Germinación y Sanidad de Semillas. 2006 SEED NEWS. Año X Nº 1 INSS 1415-0387. Pag:8-9

Henning, A.A. Patología e Tratamento de Sementes: Nocoes Gerais. 2004.Documentos 235. ISSN 1516-781X. EMBRAPA. Londrina. Pag. 51

International Seed Testing Association (ISTA) . 2003. International Rules for Seed Testing. ISBN 3-906549-38-0 P.O. BOX 308, 8303 Basserdorf, CH- Switzerland, Suiza. Pag. 500

International Seed Testing Association (ISTA) . 2003. International Rules for Seed Testing. Annexe to Chapter 7 Seed Health Testing Seed HeaIth Testing Methods. SBN 3-906549-38-0 P.O. BOX 308, 8303 Basserdorf, CH- Switzerland, Suiza. Pag. 148

Autores:
M. R. Arango Perearnau* ; R. M. Craviotto; C. Gallo
INTA Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria, Estación Experimental Agropecuaria Oliveros. Ruta Nacional 11 KM 353. Oliveros. Tel (03476)498010. marango@correo.inta.gov.ar *, rcraviotto@arnet.com.ar, cgallo@correo.inta.gov.ar